孤発性アルツハイマー病の発症における新しいリスク遺伝子の同定

藤田 亮介
（米国Columbia大学Department of Pathology & Cell Biology）
email：藤田亮介

要 約

　孤発性アルツハイマー病は，アポリポタンパク質E4など遺伝的な要因と，加齢など非遺伝的な環境要因により，その発症リスクが増加することが知られている．この研究では，孤発性アルツハイマー病の発症機構を知るため，アポリポタンパク質Eのアイソフォームのひとつをコードする対立遺伝子APOEε4遺伝子の保有者，および，孤発性アルツハイマー病の患者における遺伝子発現の変動について，全トランスクリプトームにおいてその差異を解析することによりリスク遺伝子を同定するとともに，その遺伝子発現の変動のマスターレギュレーターとなる遺伝子を遺伝子発現差異相関解析法により同定した．マスターレギュレーターの候補として見い出された遺伝子には，アルツハイマー病においてその機能が既知の遺伝子と新規の遺伝子とがあった．今回の解析から，これら遺伝子の多くはアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスやプロセシングを制御していることが明らかになり，さらに，アルツハイマー病に関連する新規の候補遺伝子であるRNF219遺伝子の多型は，孤発性アルツハイマー病の発症および脳へのアミロイドβタンパク質の蓄積と強く関連することが明らかになった．したがって，今回，新たに見い出されたAPOEε4遺伝子と関連する遺伝子は，孤発性アルツハイマー病の発症に重要な役割をはたしていることが示唆された．

はじめに

　アルツハイマー病は痴呆症の原因の大部分をしめ，今後も全世界規模で患者数が増大することが懸念されている．多くの神経変性疾患と同様に，アルツハイマー病にも家族性の発症が認められ，その原因遺伝子として，アミロイド前駆体タンパク質をコードするAPP遺伝子，Presenilin-1をコードするPSEN1遺伝子，Presenilin-2をコードするPSEN2遺伝子の変異が発見されている¹⁾．一方で，90％近いアルツハイマー病の患者はこれら家族性アルツハイマー病の原因遺伝子に変異が認められず，さらに，家族性アルツハイマー病の発症に比べ発症年齢の遅い，いわゆる，孤発性アルツハイマー病である．アルツハイマー病を発症した患者の脳には，細胞の間隙にアミロイドβタンパク質の蓄積（老人斑）と，ニューロンに過剰にリン酸化された細胞骨格タンパク質Tauの凝集体（神経原線維変化）の形成が，おもな病理像として認められる²⁾．これらの変調にともない，ニューロンの脱落や神経ネットワークの破綻，脳における炎症反応などが惹起され，記憶認知障害を主徴とする症状が発現すると考えられている．アルツハイマー病に対する研究は非常に多岐にわたって進められており，とくに，家族性アルツハイマー病の原因遺伝子については各種のマウスモデルが作製され多くの研究成果が報告されている．一方，近年では，孤発性アルツハイマー病に対しても大規模なゲノム解析が行われ，いくつかのリスク遺伝子が同定されるにいたっている，そのなかでも，アポリポタンパク質Eのアイソフォームのひとつをコードする対立遺伝子APOEε4遺伝子の保有者にはアルツハイマー病の発症の3～10倍の増加が認められ，最大のリスク遺伝子と考えられている³⁾．
　今回の研究では，孤発性アルツハイマー病の発症機構を解明するため，患者の脳に由来する全トランスクリプトームにおいて遺伝子発現の差異を解析するとともに，遺伝子発現差異相関解析法を用いた遺伝子発現ネットワークの解析を組み合わせ，孤発性アルツハイマー病における遺伝子発現の変動のマスターレギュレーターの探索を試みた．

1．APOEε4遺伝子の保有により発現の変動した遺伝子には孤発性アルツハイマー病の発症に関連する遺伝子が含まれる

　これまで行われてきた健常者群とある特定の疾患の患者群との発現遺伝子の比較解析は，多くの場合，疾患の発症初期から発症にともなう2次的な変調まで，すべての遺伝子発現の変動を含め解析してきた．しかしながら，知りたい情報は発症の原因に関連する遺伝子発現の変動や病態に直接的に関連する遺伝子発現の変動である．そこで今回は，孤発性アルツハイマー病の発症の原因に関連する遺伝子発現の変動を見い出すため，孤発性アルツハイマー病のリスク遺伝子であるAPOEε4遺伝子に着目した．多くのヒトはアポリポタンパク質Eをコードする遺伝子として対立遺伝子APOEε3遺伝子を保有しているが，全体の14％は112番目のCysがArgに変異したアポリポタンパク質E4をコードする対立遺伝子APOEε4遺伝子を保有しており，8％は158番目のArgがCysに変異したアポリポタンパク質E2をコードする対立遺伝子APOEε2遺伝子を保有している．興味深いことに，アルツハイマー病の発症リスクはAPOEε4遺伝子の保有者では増加するがAPOEε2遺伝子の保有者では減少することが明らかになっており，一方，家族性高脂血症の場合，APOEε2遺伝子の保有者では発症リスクが上昇することが明らかになっている⁴⁾．
　まず，健常者（アルツハイマー病は未発症）かつAPOEε4遺伝子保有者，および，孤発性アルツハイマー病患者かつAPOEε4遺伝子非保有者（APOEε3遺伝子保有者）の大脳皮質の試料それぞれ185検体につき，全トランスクリプトームにおける遺伝子発現の変動を階層クラスタリング解析したところ，両者にみられる遺伝子発現の変動は非常に類似していることが明らかになった．そこで，アルツハイマー病未発症のAPOEε4遺伝子保有者と孤発性アルツハイマー病患者のAPOEε4遺伝子非保有者とのあいだで共通した発現の変動を示す遺伝子が，アルツハイマー病発症のきわめて早い時期に発現の変動する遺伝子，あるいは，発症のリスク遺伝子と考えられることから，このような遺伝子の探索を試みた．まず，APOEε4遺伝子保有者により特徴的な遺伝子発現の変動を見い出すため，アルツハイマー病未発症のAPOEε4遺伝子保有者とアルツハイマー病未発症のAPOEε2遺伝子保有者とのあいだで遺伝子発現の比較解析を行った．一方で，孤発性アルツハイマー病に特徴的な遺伝子発現の変動を見い出すのに健常者群とアルツハイマー病発症群との比較を行うが，この場合，アポリポタンパク質Eの影響を除外するためAPOEε3遺伝子の保有者において比較を行った．この2つの解析の結果，8449の遺伝子において発現の変動が認められ，そのうち，215の遺伝子がAPOEε4遺伝子保有者と孤発性アルツハイマー病患者とのあいだで正の相関（増加あるいは減少）をもつ発現変動，37の遺伝子が負の相関をもつ発現変動を示した（図1）．

2．孤発性アルツハイマー病の発症に関連する遺伝子の探索

　APOEε4遺伝子保有者と孤発性アルツハイマー病患者とのあいだで正の相関をもつ発現変動を示した遺伝子のなかに，いくつかの遺伝子の発現を制御するマスターレギュレーターが含まれると推測した．そして，このマスターレギュレーターが孤発性アルツハイマー病の発症におけるリスク遺伝子になると考えられた．しかしながら，このマスターレギュレーターを見い出すのに，全トランスクリプトームにおける遺伝子発現のデータから得られた遺伝子を個々に解析していくことは非常に困難である．そこで，遺伝子発現差異相関解析法（differential co-expression analysis）を用いてマスターレギュレーターの探索を試みた．遺伝子発現差異相関解析法は，全トランスクリプトームにおける遺伝子発現のデータから既知のトランスクリプトームネットワークにおける全体の遺伝子発現の変動を解析し，その変動からトランスクリプトームネットワークのノードの候補となる遺伝子を同定する方法である．その結果，20個のマスターレギュレーター候補遺伝子が同定された．これらの遺伝子には，APBA2遺伝子，IMT2B遺伝子，TMEM59L遺伝子，FYN遺伝子など，すでにアミロイド前駆体タンパク質の細胞内での局在の変動あるいはプロセシングにかかわることが報告されている遺伝子も含まれていた．また，候補遺伝子のひとつSV2A遺伝子はニューロンにおいてエンドサイトーシスを制御するタンパク質をコードしており⁵⁾，この阻害剤であるLevetiracetamはすでに抗てんかん薬として臨床で使用されている．また，最近の報告では，孤発性アルツハイマー病の発症にさきだって起こる軽度の認知障害において認められる，海馬のニューロンの過剰な興奮を抑制することにより認知機能を改善するとされている⁶⁾．一方，候補遺伝子のひとつRNF219遺伝子については，これまでアルツハイマー病との関連はまったく報告されていなかったが，脂質代謝や認知機能への関与など，APOEε4遺伝子による病態と類似した病態にかかわることが報告されている^7-9)．
　そこで，遺伝子発現差異相関解析法により見い出された候補遺伝子がAPOE4に依存したアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングに関与するかどうかをin vitroにおける系を用いて検討した．ヒトの野生型のアミロイド前駆体タンパク質を過剰に発現させたマウス神経芽細胞腫を準備し，この細胞において候補遺伝子の発現をそれぞれ対応するshRNAを用いてノックダウンし，培養上清に産生されたアミロイドβタンパク質の量をELISA法により測定した．アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現させたマウス神経芽細胞腫に対し組換えヒトAPOE2あるいは組換えヒトAPOE4を処理すると，組換えヒトAPOE4の処理においてのみ，アミロイドβタンパク質のアイソフォームであるAβ40およびAβ42の産生がそれぞれ2倍ほど増加することが明らかになった．そこで，この条件において候補遺伝子の発現をノックダウンしたところ，RNF219遺伝子，SV2A遺伝子，HDLBP遺伝子，ROGDI遺伝子，CALU遺伝子，PTK2B遺伝子において，Aβ40およびAβ42の産生の有意な減少が認められた．したがって，遺伝子発現差異相関解析法により見い出された候補遺伝子のいくつかは，APOE4に依存したアミロイドβタンパク質の産生に関連する遺伝子であると考えられた．

3．アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおけるSV2Aの役割

　候補遺伝子のAPOE4に依存的なアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおける役割について，より詳細な検討を行った．しかしながら，すべての候補遺伝子に対し検討を行うことは困難なため，上位2つ，RNF219遺伝子とSV2A遺伝子について検討した．アミロイドβタンパク質の産生にいたるアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングは2つのステップから成り立っている．はじめに，βセクレターゼ（おもに，BACE1）による切断によりアミロイド前駆体タンパク質からsAPPβ（N末端側，細胞外タンパク質）とC99（C末端側，膜貫通タンパク質）が産生される．BACE1は酸性条件（pH 3～6）においてプロテアーゼ活性をもつため，初期エンドソームや後期エンドソームなどのオルガネラにおいてアミロイド前駆体タンパク質は切断される．つぎに，Presenilinを含むタンパク質複合体であるγセクレターゼが細胞膜に存在するC99を切断し，アミロイドβタンパク質（N末端側）とAICD（C末端側，細胞内タンパク質）を産生する．このとき，γセクレターゼの活性化に依存してアミロイドβタンパク質の長さが変動する（Aβ40あるいはAβ42）と考えられている．
　すでに述べたように，SV2A遺伝子のノックダウンではアミロイドβタンパク質の産生は有意に減少したが，その前駆体であるsAPPβの量も有意に減少した．同様の結果はC99についても確認された．その一方で，アミロイド前駆体タンパク質の量はSV2A遺伝子のノックダウンおよび組換えヒトAPOE4の処理により変化が認められなかったことから，SV2Aはβセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質の切断に促進的に作用していることが示唆された．また，アミロイド前駆体タンパク質は通常はオルガネラ膜および細胞膜に局在しており，組換えヒトAPOE4の処理によりアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスが促進されることが，これまでの報告と同様に再現された．SV2A遺伝子のノックダウンでは，APOE4に依存したアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスのみならず，恒常的に誘導されるアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスも減少することが明らかになった．この機能は，SV2AのAP2結合部位における変異体の過剰発現系においても再現されたことから，SV2Aがクラスリン依存型のエンドサイトーシスを介しアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスを制御するとともに，APOE4の存在下ではより積極的にエンドサイトーシスを促進していることが明らかになった．今回の検討では，アポリポタンパク質E受容体の同定にはいたらなかったが，これまで，アポリポタンパク質E受容体とアミロイド前駆体タンパク質との相互作用をFE65およびX11ファミリータンパク質が補助することにより協調的にはたらいていること，アポリポタンパク質E受容体はクラスリン依存型のエンドサイトーシスをひき起こすことなど，今回の結果を強く支持する結果が報告されている³⁾．
　このようにSV2Aの機能が明らかになったが，実際に，SV2Aがヒトのニューロンにおけるアミロイドβタンパク質の産生に影響していることを確認するため，これまでに確立した，ヒトの皮膚細胞よりiPS細胞を介さず直接にニューロンを誘導する手法を用いて検討を行った．非常に興味深いことに，APOEε4遺伝子保有者の皮膚細胞より誘導したニューロンでは，APOEε4遺伝子非保有者（APOEε3遺伝子のみ保有）の皮膚細胞より誘導したニューロンと比較して，アミロイドβタンパク質の2倍強の増加が認められた．このとき，悪性化の一種の指標であるAβ42/Aβ40比は変化しなかった．そこで，この系に対しSV2Aの阻害剤であり抗てんかん薬として臨床に応用されているLevetiracetamを処理したところ，Aβ42およびAβ40の産生は有意に減少した．さらに，APOEε4遺伝子保有者より誘導したニューロンにみられた，アミロイド前駆体タンパク質とBACE1との細胞内での共局在の増加に対しても，同様の結果が示された．

4．孤発性アルツハイマー病の新規のリスク遺伝子RNF219遺伝子

　遺伝子発現差異相関解析法により見い出されたRNF219遺伝子は，2つのコイルドコイルドメインと1つのリングフィンガードメインをもつ726残基（マウスでは，722残基）からなるタンパク質をコードしていた．このRNF219はこれまでほとんど機能解析をされていなかったため，SV2Aと同様の解析を行った．RNF219遺伝子のshRNAを用いたノックダウンでは，APOE4に依存したアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスが有意に抑制されたが，SV2A遺伝子のノックダウンとは異なり，恒常的に誘導されるアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスや，BACE1のエンドサイトーシスについて影響はなかった．そこで，このような機能がタンパク質のどの領域によるのか検討するため，リングフィンガードメインに着目し，このドメインを含むN末端から77残基を除去した欠失変異体，および，リングフィンガードメインの機能を失わせた1残基変異体を作製し，これらを過剰に発現させることによりアミロイドβタンパク質の産生に対する影響について検討した．その結果，これら2種類の変異体はAPOE4に依存したアミロイドβタンパク質の産生を有意に抑制した．RNF219は細胞内においてほとんどが核に局在し，APOE4に依存したアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスに対し，RNF219自体が直接に作用して影響をあたえているとは考えにくい．RNF219の詳細な機能解析については，今後の課題である．
　一方で，RNF219遺伝子の多型解析では，FYN遺伝子とともに，APOEε4遺伝子非保有者においてアルツハイマー病の発症年齢を有意に低下させることが，4つの公共データベースを用いた解析から明らかになった．そこで，in vitroにおける解析の結果をふまえ，RNF219遺伝子のSNP（rs2248663）において生体でアミロイドβタンパク質の蓄積が認められるかどうかを陽電子断層法（positron emission tomography：PET）により解析した．すでに，APOEε4遺伝子保有者はAPOEε4遺伝子非保有者と比較してアミロイドβタンパク質の蓄積の有意な増加が健常者とアルツハイマー病患者の両方で観察されていたが¹⁰⁾，今回，RNF219遺伝子におけるrs2248663の保有者かつAPOEε4遺伝子非保有者では，APOEε4遺伝子保有者と同じ程度までアミロイドβタンパク質の蓄積が増加していることが明らかになった．一方で，RNF219遺伝子におけるrs2248663の保有者かつAPOEε4遺伝子保有者においてはさらなる増加は認められなかったことから，RNF219遺伝子の多型とアポリポタンパク質Eの遺伝子の多型には遺伝的な相互作用のあることが示唆された．

おわりに

　今回の一連の研究により，孤発性アルツハイマー病の発症にかかわるマスターレギュレーターの候補遺伝子を発見した．一方で，今回はアルツハイマー病におけるアミロイドβタンパク質の産生の増加を指標として解析を試みたが，アミロイドβタンパク質の除去機能の低下を含めたアミロイドβタンパク質仮説にもとづく発症機構や，リン酸化Tauの蓄積による神経原線維変化においても，発症の原因を担うマスターレギュレーターは存在するはずであり，今回，見い出された候補遺伝子はこれらの病態の変化への関与も示唆される．今後，これら候補遺伝子の分子基盤の解明が孤発性アルツハイマー病の病態における全容の解明において重要であろう．

文 献

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